前言

駱清銘院士和龔輝教授帶領(lǐng)MOST團(tuán)隊(duì)發(fā)明的熒光顯微光學(xué)切片斷層成像系列技術(shù)（fluorescence Micro-Optical Sectioning Tomography，fMOST）作為介觀尺度最精細(xì)的三維成像技術(shù)，伴隨著各種標(biāo)記技術(shù)和數(shù)據(jù)處理技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已在神經(jīng)機(jī)制研究、腦疾病研究、心血管疾病研究以及病理毒理等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

近半年來，應(yīng)用fMOST技術(shù)的學(xué)術(shù)研究碩果累累，并刊登在Nature Neuroscience、Advanced Science、Nature Communications、PNAS等多篇知名國際期刊上。小編精心整理了其中14篇典型應(yīng)用文章，包含神經(jīng)圖譜研究、阿爾茨海默癥研究、新穎標(biāo)志物全腦成像、多組織器官成像、功能成像聯(lián)用，供學(xué)術(shù)分享。

1. 小鼠前額葉單神經(jīng)元投射圖譜

2022年3月31日，中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心與MOST團(tuán)隊(duì)合作在Nature Neuroscience期刊以封面文章的形式在線發(fā)表了題為Single-neuron projectome of mouse prefrontal cortex的研究論文。該研究在國際介觀圖譜領(lǐng)域率先重構(gòu)了小鼠前額葉皮層6357個單神經(jīng)元全腦投射圖譜，建立了國際上最大的小鼠全腦介觀神經(jīng)聯(lián)接圖譜數(shù)據(jù)庫；首次發(fā)現(xiàn)小鼠前額葉皮層中存在64類神經(jīng)元投射亞型，揭示了其空間分布規(guī)律，闡明了前額葉內(nèi)部模塊化的連接網(wǎng)絡(luò)和等級結(jié)構(gòu)、神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄組亞型與投射亞型的對應(yīng)關(guān)系，從而揭示了前額葉皮層內(nèi)部連接和外部投射的規(guī)律，并提出了前額葉皮層可能的工作模型。該研究不僅為深入研究高級認(rèn)知功能的神經(jīng)機(jī)制奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也為研究全腦介觀神經(jīng)聯(lián)接圖譜提供了重要的技術(shù)支撐。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41593-022-01041-5

2. 帶突觸信息的全腦神經(jīng)投射圖譜

2022年9月26日，MOST團(tuán)隊(duì)在期刊PNAS在線發(fā)表了研究論文Dissection of the long-range projections of specific neurons at the synaptic level in the whole mouse brain，該研究通過特殊設(shè)計(jì)的AAV病毒(AAV2/9-hSyn-flex-tdTomato-T2A-synaptophysin-EGFP-WPRE-pA）實(shí)現(xiàn)軸突與突觸前結(jié)構(gòu)共標(biāo)記，在正常與阿爾茲海默癥（AD）模型鼠中分別解析了基底前腦神經(jīng)元的長程投射模式，解決了全腦高分辨率數(shù)據(jù)集獲取與分析中樣本制備等環(huán)節(jié)的技術(shù)難點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了多種熒光蛋白的微弱信號保持。利用fMOST以0.23 μm × 0.23 μm × 1 μm體素分辨率獲取了全腦連續(xù)數(shù)據(jù)集，分析了神經(jīng)環(huán)路的投射模式和關(guān)鍵腦區(qū)內(nèi)突觸前結(jié)構(gòu)的分布規(guī)律。

該研究建立了在突觸水平解析特定類型神經(jīng)元長程投射模式的研究方法，繪制了基底前腦PV神經(jīng)元帶有突觸信息的全腦投射圖譜，并探究了其在AD的退行變化，為解析生理和病理?xiàng)l件下特定類型神經(jīng)元全腦突觸連接模式提供了新的思路。

原文鏈接：https://doi.org/10.1073/pnas.2202536119

3. 未定帶GABA能神經(jīng)元全腦連接組

2022年8月19日，MOST團(tuán)隊(duì)在期刊Neuroscience Bulletin發(fā)表題為Whole?Brain Connectome of GABAergic Neurons in the Mouse Zona Incerta的研究論文。未定帶（Zona incerta, ZI）是外側(cè)下丘腦中的一個以抑制性GABA能神經(jīng)元為主的腦區(qū)，該研究利用嗜神經(jīng)病毒環(huán)路示蹤工具和Vgat-ires-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠分別標(biāo)記其中的GABA能神經(jīng)元的輸入神經(jīng)元胞體和投射纖維，并采用fMOST繪制了ZI的GABA能神經(jīng)元的全腦輸入和輸出圖譜，比較了不同亞區(qū)之間輸入以及輸出，闡述了ZI與主要連接腦區(qū)之間的連接模式。該研究為ZI的功能研究建立了解剖學(xué)數(shù)據(jù)集和參考圖譜，也從新的視角解析了腦的環(huán)路組織規(guī)律。

原文鏈接：https://doi.org/10.1007/s12264-022-00930-w

3. 初級聽覺皮層神經(jīng)元聯(lián)接圖譜

初級聽覺皮層（primary auditory area, AUDp）是大腦聽覺皮層中處理聲音信息的關(guān)鍵區(qū)域。然而，對AUDp中特定類型神經(jīng)元在全腦范圍內(nèi)長程聯(lián)接模式的全面認(rèn)識仍然缺乏。2022年3月21日MOST團(tuán)隊(duì)在期刊Neuroscience Bulletin上發(fā)表題為Whole-Brain Direct Inputs to and Axonal Projections from Excitatory and Inhibitory Neurons in the Mouse Primary Auditory Area的研究論文。本研究采用dfMOST結(jié)合Cre轉(zhuǎn)基因小鼠及病毒示蹤技術(shù)，在亞微米分辨率水平獲取了AUDp中興奮型和抑制型神經(jīng)元的全腦輸入輸出三維連續(xù)數(shù)據(jù)集。為了更加準(zhǔn)確地闡明AUDp中特定類型神經(jīng)元的直接輸入和軸突投射的規(guī)律，該研究建立了全腦輸入輸出神經(jīng)環(huán)路的自動化分析流程，通過對上游神經(jīng)元胞體及下游軸突投射信號的自動識別和分割，及將整個數(shù)據(jù)集配準(zhǔn)到統(tǒng)一的坐標(biāo)體系中，實(shí)現(xiàn)了對AUDp輸入輸出環(huán)路在三維空間內(nèi)的定量解析，這為進(jìn)一步探究其生理功能提供了新的見解。

原文鏈接：https://doi.org/10.1007/s12264-022-00838-5

4. 全腦AB斑塊高精度全景圖

2022年4月19日，中科院上海藥物所MOST及圖像融合分析技術(shù)服務(wù)部與臨港實(shí)驗(yàn)室科研人員合作在Frontiers in Neuroscience雜志上發(fā)表了題為High-Resolution Digital Panorama of Multiple Structures in Whole Brain of Alzheimer's Disease Mice的研究論文。該研究對基于MOST系統(tǒng)獲得的全腦Nissl染色數(shù)據(jù)集，設(shè)計(jì)出針對相鄰灰度區(qū)間內(nèi)多種結(jié)構(gòu)元素的信息提取及重建策略，首次實(shí)現(xiàn)了基于Nissl染色的小鼠全腦Aβ斑塊分布可視化，在同一小鼠全腦中構(gòu)建了Aβ斑塊及其周圍胞體、神經(jīng)樹突、神經(jīng)束和血管的高精度全景圖。研究成果為深入理解AD相關(guān)病理狀態(tài)下的大腦解剖結(jié)構(gòu)特征提供了新思路。

原文鏈接：https://doi.org/10.3389/fnins.2022.870520

5. 全腦AB斑塊實(shí)時(shí)染色技術(shù)

2022年5月7日，Chemical Engineering Journal在線刊登了MOST團(tuán)隊(duì)題為AIE-based fluorescent micro-optical sectioning tomography for automatic 3D mapping of β-amyloid plaques in Tg mouse whole brain的研究論文。研究人員報(bào)道了一種水溶性熒光探針AIEgens，該探針可在1 min內(nèi)快速滲透小鼠腦組織并將Aβ斑塊染色至8 μm深度。結(jié)合fMOST技術(shù)，通過原位逐層切削和AIEgens探針實(shí)時(shí)染色的循環(huán)過程，實(shí)現(xiàn)了Tg小鼠全腦Aβ斑塊的自動三維成像。這種方便、高效的策略無需組織滲透、熒光預(yù)標(biāo)記和繁瑣的洗滌過程，顯著提高了標(biāo)記效率。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2022.136840

6. 膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)全腦成像

2022年7月3日，蘇州大學(xué)蘇州醫(yī)學(xué)院王琳輝、徐廣銀團(tuán)隊(duì)在期刊Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism發(fā)表了題為High-resolution 3D demonstration of regional heterogeneity in the glymphatic system的文章。研究人員巧妙地將熒光右旋糖酐（Dex-3）注入到小鼠小腦延髓池中以標(biāo)記腦脊液(CSF)，接著對同一只小鼠進(jìn)行Dylight594-lectin尾靜脈注射以標(biāo)記全腦血管。之后分別在30分鐘后和120分鐘后取腦并固定，分別利用fMOST展現(xiàn)CSF內(nèi)流入腦和間質(zhì)液(ISF)從腦中清除的途徑和特征。該研究首次獲得了高分辨率的全腦膠質(zhì)淋巴結(jié)構(gòu)，三維展示了全腦CSF流入和流出通路，揭示了膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)的腦區(qū)異質(zhì)性，為進(jìn)一步研究膠質(zhì)淋巴功能提供了解剖學(xué)基礎(chǔ)。

原文鏈接：https://doi.org/10.1177/0271678X221109997

7. c-fos陽性細(xì)胞全腦定位

2022年9月，西安交通大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在期刊Neurobiology of Stress發(fā)表題為Brain-wide mapping of c-Fos expression with fluorescence micro-optical sectioning tomography in a chronic sleep deprivation mouse model的研究論文。慢性睡眠剝奪(SD)可導(dǎo)致包括抑郁、焦慮、中風(fēng)、永久性認(rèn)知缺陷、壓力等疾病。Fos基因作為一種腦活動功能標(biāo)記在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，然而以往研究大多只是用傳統(tǒng)方法或短期SD模型分析大腦某些區(qū)域c-Fos。在本研究中，作者通過fMOST和高血腦屏障通透性AAV-PHP.eB病毒對睡眠剝奪模型小鼠進(jìn)行全腦c-Fos+細(xì)胞定位。結(jié)果表明，睡眠剝奪14天后，小鼠表現(xiàn)出焦慮樣和抑郁樣行為，多個腦區(qū)發(fā)生c-Fos的激活表達(dá)，為慢性SD進(jìn)一步研究和治療提供了線索。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ynstr.2022.100478

8. 完整小鼠肝葉多種脈管可視化

2022年3月24日，MOST團(tuán)隊(duì)在Communications Biology期刊發(fā)表了題為Multiscale reconstruction of various vessels in the intact murine liver lobe的研究論文，團(tuán)隊(duì)利用HD-fMOST系統(tǒng)和PI實(shí)時(shí)復(fù)染技術(shù)建立了一套同時(shí)獲取和可視化小鼠完整肝葉內(nèi)的多尺度多類型脈管的方法。通過形態(tài)差異，將肝靜脈、肝動脈、肝內(nèi)膽管、肝內(nèi)淋巴管進(jìn)行了信息分割和可視化，并重建了局部肝竇和膽管周圍血管叢。為肝病中脈管結(jié)構(gòu)細(xì)微病理變化研究提供了技術(shù)路線，也為單細(xì)胞水平研究肝臟等富含脈管結(jié)構(gòu)的器官提供了新思路和高效技術(shù)手段。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s42003-022-03221-2

9. 完整器官亞細(xì)胞分辨三維成像

2022年7月20日，MOST團(tuán)隊(duì)在Cell Press細(xì)胞出版社旗下交叉學(xué)科期刊iScience上發(fā)表了題為Cryo-fluorescence micro-optical sectioning tomography for volumetric imaging of various whole organs with subcellular resolution的研究論文。該團(tuán)隊(duì)發(fā)展了一種低溫?zé)晒怙@微光學(xué)切片斷層成像（cryo-fMOST）技術(shù)，以亞微米體素分辨率分別對正常小鼠的舌頭、腎臟和腦以及心梗疾病模型鼠的心臟等完整器官進(jìn)行了三維成像與重建，高保真地獲取了精細(xì)解剖結(jié)構(gòu)。并進(jìn)一步對收集到的已成像冰凍腦片做了磷酸糖測定和熒光原位成像，初步展示了cryo-fMOST與多組學(xué)測量的兼容性，表明該技術(shù)有望用于空間多組學(xué)的研究。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.isci.2022.104805

10. 完整心臟的心肌構(gòu)筑和血管網(wǎng)絡(luò)

2022年8月4日，MOST團(tuán)隊(duì)在Frontiers in Cardiovascular Medicine期刊發(fā)表了題為Three-dimensional visualization of heart-wide myocardial architecture and vascular network simultaneously at single-cell resolution的研究論文。借鑒所在團(tuán)隊(duì)自主建立的fMOST思路，發(fā)展了一種測繪完整心臟介觀精細(xì)結(jié)構(gòu)的新技術(shù)，解決了心臟組織結(jié)構(gòu)的熒光標(biāo)記、高分辨全自動成像及數(shù)據(jù)處理中的技術(shù)難題，以0.32 μm×0.32 μm×1 μm的體素分辨率實(shí)現(xiàn)了小鼠全心臟三維連續(xù)數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)獲取和重建。該技術(shù)方案基于Tek-cre*Ai47轉(zhuǎn)基因小鼠對血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行熒光標(biāo)記，并在成像過程實(shí)時(shí)染色心肌細(xì)胞；利用HD-dfMOST，采用線照明調(diào)制光學(xué)層析成像與超薄切削樹脂包埋組織相結(jié)合的策略，通過成像-切削的循環(huán)實(shí)現(xiàn)了小鼠全心臟的三維高分辨率連續(xù)數(shù)據(jù)的獲取。

原文鏈接：https://doi.org/10.3389/fcvm.2022.945198

11. 完整大腦類器官細(xì)胞組成和形態(tài)分析

2022年8月26日，MOST團(tuán)隊(duì)在期刊biology發(fā)表論文Multiscale Analysis of Cellular Composition and Morphology in Intact Cerebral Organoids 該研究利用人類皮膚來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）培養(yǎng)獲得大腦類器官，并使用慢病毒pLenti-hSyn-EGFP-P2A-MCS-WPRE,pLenti-shortGFAP-mCherry-WPRE(或pLenti-GfaABC1D-EGFP-WPRE)分別標(biāo)記神經(jīng)元和GFAP+細(xì)胞，結(jié)合fMOST技術(shù)，獲得亞微米級完整大腦類器官種神經(jīng)元和GFAP+細(xì)胞的空間分布，并對單細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行分析。同時(shí)，研究者利用整體3D免疫熒光分析了分化皮層神經(jīng)元marker SATB+和TBR1+的空間分布情況，結(jié)果顯示超過95%的標(biāo)記細(xì)胞分布在類器官外層。這一套新方法能夠獲取亞微米級類器官的高分辨率空間信息，用于分析其細(xì)胞組成和形態(tài)，將成為揭示大腦或其他類器官細(xì)胞組成、結(jié)構(gòu)、發(fā)育和病理變化的有力工具。

原文鏈接：https://doi.org/10.3390/biology11091270

12. 全腦功能聯(lián)接圖繪制新技術(shù)

2022年3月22日，重慶大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)智能研究中心汪萌/廖祥團(tuán)隊(duì)與MOST團(tuán)隊(duì)等機(jī)構(gòu)合作，在國際期刊Nature Communications發(fā)表論文Brain-wide projection reconstruction of single functionally defined neurons，該研究建立了一種稱為2-SPARSE的新技術(shù)，綜合了雙光子鈣成像、單細(xì)胞電轉(zhuǎn)、病毒標(biāo)記和fMOST全腦成像等方法，可實(shí)現(xiàn)對特定功能的單個神經(jīng)元全腦范圍內(nèi)的形態(tài)投射進(jìn)行重建。2-SPARSE避免了以往病毒標(biāo)記策略的隨機(jī)性和不確定性，尤其適用于解析缺少分子marker或者數(shù)目稀少但在特定腦區(qū)又廣泛分布的功能性神經(jīng)元。2-SPARSE有望推進(jìn)當(dāng)前腦科學(xué)由單神經(jīng)元投射組學(xué)向單神經(jīng)元功能投射組學(xué)的發(fā)展。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-29229-0

13. 細(xì)胞類型特異單神經(jīng)元全腦功能投射

2022年10月13日，MOST團(tuán)隊(duì)在Advanced Science期刊在線發(fā)表論文Mapping the function of whole-brain projection at the single neuron level，研究采用rAAV體系的二元表達(dá)系統(tǒng)，用遺傳型鈣探針GCaMP6稀疏標(biāo)記神經(jīng)元，通過活體鈣成像方法，記錄清醒小鼠神經(jīng)元的視覺功能響應(yīng)；利用HD-fMOST獲取GCaMP6標(biāo)記神經(jīng)元的全腦解剖形態(tài)和位置信息；通過項(xiàng)目組開發(fā)的方法實(shí)現(xiàn)跨模態(tài)細(xì)胞匹配，整合活體鈣成像與高分辨率的全腦結(jié)構(gòu)成像的信息，得到單神經(jīng)元水平全腦投射的功能注釋（functional annotation of whole-brain projection at the single neuron level, FAWPS)，由此建立了獲取同一神經(jīng)元的功能響應(yīng)特征和軸突全腦投射信息的方法。該研究建立了能對特定類型神經(jīng)元進(jìn)行單細(xì)胞分辨的神經(jīng)活動成像，并繪制出同一個神經(jīng)元在全腦范圍精細(xì)軸突投射的方法。該方法結(jié)合遺傳型功能探針稀疏標(biāo)記、活體雙光子熒光成像、高清fMOST全腦精細(xì)結(jié)構(gòu)成像和跨模態(tài)細(xì)胞匹配等多項(xiàng)技術(shù)，能獲取同一神經(jīng)元的神經(jīng)活動與全腦投射信息，并在單神經(jīng)元水平探索了功能偏好與軸突投射特性的關(guān)系。

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202202553